Loạt phim tập trung vào Lain Iwakura, một nữ sinh trung học vị thành niên sống ở ngoại ô Nhật Bản, và giới thiệu về Wired, một mạng lưới truyền thông toàn cầu tương tự như Internet. Lain sống với gia đình thuộc tầng lớp trung lưu trong xã hội, bao gồm chị gái Mika vô cảm, người mẹ có gì đó xa cách và người cha nghiện máy vi tính; trong khi bản thân Lain lại có phần vụng về, sống nội tâm và bị cô lập về mặt xã hội với hầu hết các bạn cùng trường. Tuy nhiên, hiện trạng cuộc sống của cô càng trở nên tồi tệ bởi một loạt các sự cố kỳ lạ bắt đầu xảy ra sau khi cô biết rằng các bạn gái cùng trường của cô đã nhận được e-mail từ một học sinh tự sát, Chisa Yomoda, và cô mở máy tính lên để kiểm tra tin nhắn tương tự. Lain thấy Chisa nói với cô rằng cô không hề chết, chỉ đơn thuần là "từ bỏ tiếp xúc vật lý và thể xác" và sống chìm vào trong thế giới thực tế ảo của Wired, nơi cô tìm thấy sự toàn năng và một thế lực thần thánh gọi là "Chúa". Từ thời điểm này, Lain bị cuốn vào một loạt các sự kiện khó hiểu và siêu thực khi cô đào sâu vào bí ẩn của mạng trong một câu chuyện khám phá các chủ đề về ý thức, nhận thức và bản chất của thực tại.

"Wired" là một thế giới thực tế ảo có chứa và hỗ trợ rất nhiều tất cả các mạng và giao tiếp của con người, được tạo ra cùng điện báo, TV và dịch vụ điện thoại, và mở rộng với Internet, không gian mạng và các mạng sau này. Sê-ri giả định rằng Wired có thể được liên kết với một hệ thống cho phép giao tiếp vô thức giữa người và máy mà không cần giao diện vật lý. Cốt truyện giới thiệu một hệ thống như vậy với cộng hưởng Schumann, một đặc tính của từ trường Trái đất về mặt lý thuyết cho phép truyền thông đường dài không bị cản trở. Nếu một liên kết như vậy được tạo ra, mạng sẽ trở nên tương đương với Thực tại như là sự đồng nhất chung của tất cả các nhận thức và tri thức. Ranh giới vô hình ngày càng mỏng giữa cái thật và cái ảo/kỹ thuật số bắt đầu tan vỡ dần.

Masami Eiri được giới thiệu là giám đốc dự án của Protocol Seven (giao thức Internet thế hệ tiếp theo) cho công ty máy tính lớn có tên gọi Phòng Thí nghiệm Tổng hợp Tachibana. Ông đã bí mật đưa code của chính sáng tạo của mình để cho mình quyền kiểm soát tuyệt đối với Wired thông qua hệ thống không dây được mô tả ở trên. Sau đó, ông đã "tải lên" bộ não, lương tâm, ý thức, trí nhớ, cảm giác, cảm xúc của chính mình - vào Wired và "chết" vài ngày sau đó, chỉ để lại thể xác của ông. Những chi tiết này được tiết lộ vào khoảng giữa của loạt phim, nhưng thực chất đó là điểm bắt đầu của Serial Experiments Lain. Masami sau đó giải thích rằng Lain sự thật là một chương trình nhiễu bằng cách nào đó khiến bức tường giữa thế giới vật chất và tinh thần sẽ sụp đổ, và ông cần cô đến Wired và "từ bỏ thể xác vật lý", như ông đã làm, để thực hiện được kế hoạch của mình. Loạt phim cho thấy ông cố gắng thuyết phục cô thông qua các biện pháp can thiệp, sử dụng lời hứa về tình yêu vô điều kiện, sự cám dỗ lãng mạn và sự quyến rũ, và thậm chí, khi mọi biện pháp đều thất bại, ông đã dùng đe dọa và vũ lực.

Anime cũng đề cập đến một trò chơi trốn tìm phức tạp giữa "Knights of the Lambda Calculus", những hacker mà Masami tuyên bố là "những tín đồ sùng bái ông thành một vị thần trong Wired", và Phòng thí nghiệm tổng hợp Tachibana, nhóm cố gắng giành lại quyền kiểm soát của Protocol Seven. Cuối cùng, Lain nhận thức được, sau nhiều đấu tranh nội tâm, rằng cô có quyền kiểm soát tuyệt đối đối với tâm trí của mọi người và đối với chính thực tế. Cuộc đối thoại của cô với các phiên bản khác nhau của bản thân cho thấy cô cảm thấy xa lánh thế giới vật chất như thế nào và cô sợ sống ở Wired, nơi cô có khả năng và trách nhiệm của một nữ thần toàn năng. Trong những cảnh cuối cùng có cảnh cô xóa mọi thứ liên quan đến mình khỏi ký ức của mọi người. Cô được nhìn thấy lần cuối, không hề thay đổi, gặp lại người bạn cũ nhất và thân nhất của mình là Alice, người đã kết hôn. Lain tự hứa với bản thân rằng cô và Alice chắc chắn sẽ gặp lại nhau bất cứ lúc nào vì Lain thực sự có thể đi và trở thành bất cứ nơi nào cô muốn giữa cả hai thế giới.